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在宿主細(xì)胞過量的情況下，噬斑的數(shù)量隨著噬菌體的增加呈線性增加。由于這個原因，在感染以前，要將噬菌體進(jìn)行稀釋，而不是將宿主細(xì)胞稀釋。以低MOI(感染重復(fù)性)鋪板，也可確保每一個噬斑僅包含一個DNA 序列。
材料和試劑
1. 微波爐
2. LB/IPTG/Xgal培養(yǎng) 板
3. lb培養(yǎng)基
4. 頂層瓊脂糖凝膠
操作步驟
1. 在5~10ml LB培養(yǎng)基中接種單個ER2537克隆，振搖孵育直至對數(shù)生長中期(OD600~0.5)
2. 在細(xì)胞生長時，微波融化頂層瓊脂糖凝膠，分裝至無菌培養(yǎng)管內(nèi)，每管3ml。維持在45℃?zhèn)溆谩?/div>
3. 37℃預(yù)熱LB/IPTG/Xgal培養(yǎng)板，備用。
4. 以LB培養(yǎng)基10倍比稀釋噬菌體。
建議稀釋范圍：對擴(kuò)增的噬菌體培養(yǎng)上清，108-1011;對未擴(kuò)增的篩選洗脫液，101-104。每次稀釋都換用新的加樣槍頭，最好使用氣溶膠阻隔槍頭以避免交叉污染。
5. 一旦ER2537培養(yǎng)物長至對數(shù)生長中期，分裝至微量離心管中，每管200ml。
6. 將倍比稀釋的噬菌體上清加入含細(xì)菌培養(yǎng)物的微量離心管中，一支微量離心管中僅加入一種稀釋液10ml，快速渦旋，室溫孵育1-5min。
7. 轉(zhuǎn)移至含有45℃頂層瓊脂糖凝膠的管中，快速渦旋混勻，立即傾倒至預(yù)熱的LB/IPTG/Xgal平板上，輕緩搖動平板使頂層膠均勻分布。
8. 冷卻平板5min，37℃倒置培養(yǎng)過夜。
9. 噬斑計數(shù)以噬斑數(shù)為100左右的平皿為準(zhǔn)，噬斑數(shù)乘以稀釋度即可獲得每10ml噬菌體的滴度-噬斑形成單位(pfu)。
編輯：songjiajie2010
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