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PCR檢測的那點事兒(一)

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2020-04-20  來源:食品微生物檢驗公眾號
核心提示:聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR技術(shù))又稱無細胞分子克隆法,它的鼎鼎大名在分子生物學領(lǐng)域可謂如雷貫耳,近年來無論是如日中天的精準醫(yī)療,

聚合酶鏈式反應(yīng)(PCR技術(shù))又稱無細胞分子克隆法,它的鼎鼎大名在分子生物學領(lǐng)域可謂如雷貫耳,近年來無論是如日中天的精準醫(yī)療,還是穩(wěn)步發(fā)展的基因診斷都離不開PCR技術(shù)這位“老母親”。對于檢驗檢測行業(yè)的小伙伴來說,PCR技術(shù)也絕對能夠稱得上是我們的“好幫手”了。尤其是致病菌檢測、動物源性鑒定什么的,PCR君表示毫無壓力。

然而當我們真正做好準備上機操作時,卻發(fā)現(xiàn)不是那么回事兒,總是有這樣那樣的原因?qū)е聶z測結(jié)果有誤差。今天我們就來好好分析這位“老母親”的脾氣。

PCR反應(yīng)的最大特點是具有較大擴增能力與極高的靈敏性,但令人頭痛的問題是易污染,極其微量的污染即可造成假陽性的產(chǎn)生。


 

下面開始講重點

污染原因

 

1、標本間交叉污染:

標本污染主要有收集標本的容器被污染,或標本放置時,由于密封不嚴溢于容器外,或容器外粘有標本而造成相互間交叉污染;標本核酸模板在提取過程中,由于吸樣槍污染導致標本間污染;有些微生物標本尤其是病毒可隨氣溶膠或形成氣溶膠而擴散,導致彼此間的污染。


2、PCR試劑的污染:

主要是由于在PCR試劑配制過程中,由于加樣槍、容器、雙蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。


3、PCR擴增產(chǎn)物污染:

這是PCR反應(yīng)中最主要最常見的污染問題,因為PCR產(chǎn)物拷貝量大(一般為1013拷貝/mL),遠遠高于PCR檢測數(shù)個拷貝的極限,所以極微量的PCR產(chǎn)物污染,就可造成假陽性。


還有一種容易忽視,最可能造成PCR產(chǎn)物污染的形式是氣溶膠污染;在空氣與液體面摩擦時就可形成氣溶膠,在操作時比較劇烈地搖動反應(yīng)管,開蓋時、吸樣時及污染進樣槍的反復吸樣都可形成氣溶膠而污染。據(jù)計算一個氣溶膠顆粒可含48000拷貝,因而由其造成的污染是一個值得特別重視的問題。


4、實驗室中克隆質(zhì)粒的污染:

在分子生物學實驗室及某些用克隆質(zhì)粒做陽性對照的檢驗室,這個問題也比較常見。因為克隆質(zhì)粒在單位容積內(nèi)含量相當高,另外在純化過程中需用較多的用具及試劑,而且在活細胞內(nèi)的質(zhì)粒,由于活細胞的生長繁殖的簡便性及具有很強的生命力,其污染可能性也很大。

  

5、對照試驗


a、陽性對照:在建立PCR反應(yīng)實驗室及一般的檢驗單位都應(yīng)設(shè)有PCR陽性對照,它是PCR反應(yīng)是否成功、產(chǎn)物條帶位置及大小是否合乎理論要求的一個重要的參考標志。陽性對照要選擇擴增度中等、重復性好,經(jīng)各種鑒定是該產(chǎn)物的標本,如以重組質(zhì)粒為陽性對照,其含量宜低不宜高(100以下個拷貝),但陽性對照尤其是重組質(zhì)粒及高濃度陽性標本,其對檢測或擴增樣品污染的可能性很大。因而當某一PCR試劑經(jīng)自己使用穩(wěn)定,檢驗人員心中有數(shù)時,在以后的實驗中可免設(shè)陽性對照。


b、陰性對照:每次PCR實驗務(wù)必做陰性對照。它包括①標本對照:被檢的標本是血清就用鑒定后的正常血清作對照;被檢的標本是組織細胞就用相應(yīng)的組織細胞作對照。②試劑對照:在PCR試劑中不加模板DNA或RNA,進行PCR擴增,以監(jiān)測試劑是否污染。

防止污染的方法

 

1、合理分隔實驗室:將樣品的處理、配制PCR反應(yīng)液、PCR循環(huán)擴增及PCR產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進行,特別注意樣本處理及產(chǎn)物的鑒定等步驟分區(qū)或分室進行,及PCR產(chǎn)物的鑒定應(yīng)與其它步驟嚴格分開。


最好能劃分①標本處理區(qū);②PCR反應(yīng)液制備區(qū);③PCR循環(huán)擴增區(qū);④PCR產(chǎn)物鑒定區(qū)。其實驗用品及吸樣槍應(yīng)專用,實驗前應(yīng)將實驗室用紫外線消毒以破壞殘留的DNA或RNA。

 

2、吸樣槍:吸樣槍污染是一個值得注意的問題。由于操作時不慎將樣品或模板核酸吸入槍內(nèi)或粘上槍頭是一個嚴重的污染源,因而加樣或吸取模板核酸時要十分小心,吸樣要慢,吸樣時盡量一次性完成,忌多次抽吸,以免交叉污染或產(chǎn)生氣溶膠污染。


3、預混和分裝PCR試劑:所有的PCR試劑都應(yīng)小量分裝,如有可能,PCR反應(yīng)液應(yīng)預先配制好,然后小量分裝,-20℃保存。以減少重復加樣次數(shù),避免污染機會。另外,PCR試劑,PCR反應(yīng)液應(yīng)與樣品及PCR產(chǎn)物分開保存,不應(yīng)放于同一冰盒或同一冰箱。


4、防止操作人員污染,使用一次性手套、吸頭、小離心管應(yīng)一次性使用。


5、設(shè)立適當?shù)年栃詫φ蘸完幮詫φ眨栃詫φ找阅艹霈F(xiàn)擴增條帶的最低量的標準病原體核酸為宜,并注意交叉污染的可能性,每次反應(yīng)都應(yīng)有一管不加模板的試劑對照及相應(yīng)不含有被擴增核酸的樣品作陰性對照。


6、減少PCR循環(huán)次數(shù),只要PCR產(chǎn)物達到檢測水平就適可而止。


7、選擇質(zhì)量好的Eppendorf管,以避免樣本外溢及外來核酸的進入,打開離心管前應(yīng)先離心,將管壁及管蓋上的液體甩至管底部。開管動作要輕,以防管內(nèi)液體濺出。

編輯:songjiajie2010

 
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