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一、增菌
稱取檢樣25g，加入裝有225mLGN增菌液的500mL廣口瓶內(nèi)，固體食品用均質器以8000-10000r/min打碎1min，或用乳缽加滅菌砂磨碎，粉狀食品用金屬匙或玻璃棒研磨使其乳化，于36℃培養(yǎng)6～8h。
培養(yǎng)時間視細菌生長情況而定，當培養(yǎng)液出現(xiàn)輕微混濁時即應中止培養(yǎng)。
二、分離和初步生化試驗
取增菌液1環(huán)，劃線接種于HE瓊脂平板或SS瓊脂平板1個；另取1環(huán)劃線接種于麥康凱瓊脂平板和伊紅美藍瓊脂平板各1個，于36℃培養(yǎng)18～24h。
志賀氏菌在這些培養(yǎng)基上呈現(xiàn)無色透明不發(fā)酵乳糖的菌落。
在沙門氏菌的檢驗中，有時也使用HE、SS平板進行初步篩選。
SN 0332-94 出口食品中沙門氏菌(辛酯酶熒光)檢驗方法
挑取平板上的可疑菌落，接種三糖鐵瓊脂和葡萄糖半固體各1管。一般應多挑幾個菌落，以防遺漏，經(jīng)36℃培養(yǎng)18～24h，分別觀察結果。
附：葡萄糖半固體原理及結果。
下述培養(yǎng)物可以棄去：
a. 在三糖鐵瓊脂斜面上呈蔓延生長的培養(yǎng)物；
b. 在18～24h內(nèi)發(fā)酵乳糖、蔗糖的培養(yǎng)物；
c. 不分解葡萄糖和只生長在半固體表面的培養(yǎng)物；
d. 產(chǎn)氣的培養(yǎng)物；
e. 有動力的培養(yǎng)物；
f. 產(chǎn)生硫化氫的培養(yǎng)物。
凡是乳糖、蔗糖不發(fā)酵，葡萄糖產(chǎn)酸不產(chǎn)氣(福氏志賀氏菌6型可產(chǎn)生少量氣體)，無動力的菌株，可做血清學分型和進一步的生化試驗。
三、血清學分型
挑取三糖鐵瓊脂上的培養(yǎng)物，做玻片凝集試驗。
先用4種志賀氏菌多價血清檢查，如果由于K抗原的存在而不出現(xiàn)凝集，應將菌液煮沸后再檢查；
如果呈現(xiàn)凝集，則用A1、A2、B群多價和D群血清分別試驗。
如系B群福氏志賀氏菌，則用群和型因子血清分別檢查。福氏志賀氏菌各型和亞型的型和群抗原見表1。可先用群因子血清檢查，再根據(jù)群因子血清出現(xiàn)凝集的結果，依次選用型因子血清檢查。
4種志賀氏菌多價血清不凝集的菌株，可用鮑氏多價1、2、3分別檢查，并進一步用1～15各型因子血清檢查。如果鮑氏多價血清不凝集，可用痢疾志賀氏菌3～12型多價血清及各型因子血清檢查。
附：福氏志賀氏菌各型和亞型的型抗原和群抗原
四、進一步的生化試驗
在做血清學分型的同時，應做進一步的生化試驗，即：
葡萄糖銨
西蒙氏檸檬酸鹽
賴氨酸和鳥氨酸脫羧酶
pH7.2尿素
KCN生長
水楊苷和七葉苷的分解
除宋內(nèi)氏菌和鮑氏13型為烏氨酸陽性外，志賀氏菌屬的培養(yǎng)物均為陰性結果。
。必要時還應做革蘭氏染色檢查和氧化酶試驗，應為氧化酶陰性的革蘭氏陰性桿菌。生化反應不符合的菌株，即使能與某種志賀氏菌分型血清發(fā)生凝集，仍不得判定為志賀氏菌屬的培養(yǎng)物。
已判定為志賀氏菌屬的培養(yǎng)物，應進一步做
5%乳糖發(fā)酵
甘露醇
棉子糖
甘油的發(fā)酵
靛基質試驗
志賀氏菌屬4個生化群的培養(yǎng)物，應符合該群的生化特性。但福氏6型的生化特性與A群或C群相似。
附：志賀氏菌屬四個群的生化特性
五、結果報告：綜合生化和血清學的試驗結果判定菌型并作出報告。
