1．酶標(biāo)抗體的制備
2．取材 將培養(yǎng)細(xì)胞或懸浮細(xì)胞用0.1Mol/L PBS液沖洗，離心沉淀后，立即轉(zhuǎn)入固定液(2%甲醛液或2%戊二醛液均可)pH 7.2，4℃固定5min～30min(依抗原性質(zhì)所定)。如病料為組織塊，則取適當(dāng)大小，先固定1h然后取出，以新的雙面刀片切成50～100µm的薄組織再行固定1h～2h。
3．漂洗 以PBS液漂洗過(guò)夜，換液3～4次。
4．血清孵育，25℃1h或4℃過(guò)夜，孵育的標(biāo)本放置于加蓋的瓷盤(pán)內(nèi)，底層墊數(shù)層紗布。防止抗血清干燥凝固，不易洗脫，造成非特異性吸附。
5．PBS沖洗3～4次，每次10min。
6．2.5%戊二醛再固定15min～30min。
7．PBS液沖洗3～4次每次10min。
8．酶標(biāo)記抗體孵育；用適當(dāng)稀釋的酶標(biāo)抗體(即工作濃度)于25℃濕盆內(nèi)孵育1h或4℃過(guò)夜。
9．PBS液沖洗3～4次每次10min或4℃漂洗過(guò)夜。
10．酶顯色處理 將漂洗后的標(biāo)本浸入DAB－H2O2底物溶液中，20℃，10min～30min。顯色強(qiáng)弱與戊二醛的固定有關(guān)。若顯色弱則可減少甚至取消戊二醛的固定時(shí)間。沖洗時(shí)必須注意防止非特異漂浮的沉積。
11．常規(guī)包埋、切片、電鏡觀(guān)察 在經(jīng)過(guò)脫水包埋確定抗原性不致引起失活的前提下可在包埋切片后做標(biāo)記染色，切片一般在2µm～4µm，切片后染色不存在通透困難的問(wèn)題。無(wú)論在標(biāo)記染色后切片還是在切片后標(biāo)記染色，最好在光鏡下定位選擇后，再做電鏡定位包埋，這樣目的性強(qiáng)，可減少工作量。