（一）材料與試劑
1．瓊脂粉
2．平皿
3．打孔器
4．生理鹽水或其他緩沖液，可加1/萬的硫柳汞或疊氮鈉防腐。
（二）操作方法
1．稱取一定量的瓊脂粉，按1%左右（0.8％～1.5%）的比例加入生理鹽水或緩沖液，水浴煮沸融化20min。
2．將融化的瓊脂倒入平皿內，使厚度2mm～3mm。自然冷卻。
3．根據要求（孔徑即孔的直徑，孔距即兩孔圓心之間的距離，包括兩孔的半徑）按模板打孔。也可直接用組合打孔器打孔。現在一般多打成梅花形孔圖。
4．挑出孔內瓊脂，注意不要挑破孔緣。
5．在火焰上緩緩加熱，使孔底邊緣的瓊脂少許熔化，以封底，以免加樣后液體從孔底滲漏。
6．以毛細滴管吸取樣品加入孔內，注意不要產生氣泡，以加滿為度。加少了，影響反應程度，加多了，易溢出，也影響反應結果。
7．加畢后，蓋上平皿蓋，將平皿翻過來，置濕盤中，37℃自由擴散24h～48h。
（三）結果判定
1．用以檢測抗原或比較抗原差異時，將抗血清置中心孔，將待測抗原或需比較的抗原置于周圍相鄰孔。若出現沉淀帶完全融合，證明為同種抗原；若二者有部分相連，表明二者有共同抗原決定簇；若二條沉淀線相互交叉，說明二者抗原完全不同，見下圖。
圖3-1 瓊脂免疫擴散試驗結果示意圖
中間孔含A,B,C三種抗血清，a、b和a、c為不同型的抗原（呈雙線或交叉），b、c為同一血清型的不同亞型（部分融合，有交叉）
2．用做血清流行病學調查時，將標準抗原置中心孔，周圍1、3、5孔加標準陽性血清，2、4、6孔分別加待檢血清。待檢孔與陽性孔出現的沉淀帶完全融合者判為陽性。待檢血清無沉淀帶或所出現的沉淀帶與陽性對照的沉淀帶完全交叉者判為陰性。待檢孔雖未出現沉淀帶，但兩陽性孔的沉淀帶在接近待檢孔時，兩端均內向有所彎曲者判弱陽性。若僅一端有所彎曲，另一端仍為直線者，判為可疑，需重檢。重檢時，可加大檢樣的量。
檢樣孔無沉淀帶，但兩側陽性孔的沉淀帶在接近檢樣孔時變得模糊、消失，可能為待檢血清中抗體濃度過大，致使沉淀帶溶解，可將樣品稀釋后重檢。
3．用以檢測的抗血清的效價時，將抗原置中心孔，抗血清倍比稀釋后置周圍孔，以出現沉淀帶的血清最高稀釋倍數為該抗血清的瓊擴效價。
（四）注意事項
1．不規則的沉淀線可能是加樣過滿溢出、孔型不規則、邊緣開裂、孔底滲漏、孵育時沒放水平、擴散時瓊脂變干燥、溫度過高蛋白質變性或未加防腐劑導致細菌污染等所致。
2．抗原抗體的比例與沉淀帶的位置、清晰度有關。如抗原過多，沉淀帶向抗體孔偏移和增厚，反之亦然。可用不同稀釋度的反應液試驗后調節。