物放置在一倍焦距以外兩倍焦距以內，另一側成放大倒立的實像。為了得到成像質量較高的放大效果，實際的光學顯微鏡是一組物鏡和目鏡的組合。

光學原理圖如下：

AB為物體，經物鏡放大，成倒立實像A1B1，在物鏡一倍焦距F2內，經目鏡放大成正立虛像A2B2，D為明視距離25cm，L為鏡筒長度，一般為16cm，如下圖：其中參數160即該物鏡適配長度160mm鏡筒。

為什么物鏡長放大倍數大而目鏡越短放大倍數越大？

首先，對成像造成主要影響的兩大因素，成像球面差與色差。

透鏡成像球面差：

如圖，近軸光線A1B1的匯聚點與遠軸光線AB的匯聚點不同而導致的成像差，放大倍數越大這種成像差越大。

透鏡成像色差：

如圖，不同顏色的光折射率不同，導致匯聚點不同，放大倍數越大這種成像差越大。

為了減小成像差，物鏡和目鏡都不是單個透鏡，而是有多個透鏡組成的透鏡組。而組合成的物鏡組和目鏡組都等效于一個透鏡，有顯微鏡成像原理圖可以看出，物鏡成像A1B1在目鏡的焦點附近，略小于目鏡焦距內。

顯微鏡的設計中，為了實現操作的方便與快捷（即在保持物體位置不動的情況下，更換物鏡和目鏡放大倍率，始終能夠得到清晰的像，并且位于視場中間），需要保證物鏡的像面A1B1始終與目鏡的前焦面F2附近，不需要重新調焦，物鏡和目鏡的相對位置滿足齊焦的條件，即在光學鏡筒筒長L不變的前提下，光學筒長Δ隨物鏡焦距F1的不同而不同，但是由物平面到像平面的距離M是確定不變的。選擇不同光學筒長Δ時應保持M值不變。有透鏡成像規律可知，鏡頭放大倍率越高，焦距越短，高倍物鏡成像的工作距離W.D.更短，離樣品更近，所以鏡頭更長。同理，為了保持目鏡焦距與物鏡像面A1B1重合，高倍目鏡鏡頭更短。