催化丙酮酸為乙酰CoA的不可逆反應的復合酶。EC1．2．4．1。CH₃COCOOH＋CoA＋NAD＋→CH₃C0-CoA＋NADH^-＋CO2ΔGo′＝-8.0kcal。有三種酶和五種輔助因子參于這一反應。它們組成如下系統：

　　（1）丙酮酸脫氫酶（EC4．1．1．1）

　　（2）硫辛酸轉乙酰酶（EC2．3．1．12）

　　（3）硫辛酰胺脫氫酶（EC1．6．4．3）

　　即通過丙酮酸脫羧生成的羥乙基硫胺素二磷酸和硫辛酸反應形成乙酰二氫硫辛酸，乙酰基被轉移至CoA．二氫硫辛酸通過FAD被氧化，氫最后被傳遞至NAD^＋。在這個反應循環中，除CoA和NAD外，都和酶緊密結合。該酶復合體可從動物組織和細菌中提取出來，但對從大腸桿菌中提純的研究進行得較多。復合體為直徑約30納米的多角形，似乎三種酶各含有24個分子。在生理上，好氧性糖分解時，作為從丙酮酸形成乙酰CoA的階段是極其重要的。與該酶復合體十分相似的物質有α-酮戊二酸脫氫酶的復合體。