固定
收集斑馬魚的胚胎，在Holfretor水中培養，到達所需要的發育時期時，用蛋白酶去除卵膜，用4%多聚甲醛固定，在4℃保存，二十四小時后用50%甲醇2%多聚甲醛溶液洗，然后換成甲醇，在-20C 保存，待用(兩天和兩天以上的胚胎需要用雙氧水處理，去除色素。或者使用苯锍脲稀溶液培養，可阻斷色素的形成)
一. 原位雜交第一天
1. 重新水化和固定
1） 吸取固定好的胚胎，加入50%甲醇的PBST溶液，放置5分鐘。
2） 置換成30％甲醇的PBST溶液，放置5分鐘
3） 置換成PBST溶液，放置5分鐘，重復一次
4） 置換成4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘
5） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。

蛋白酶處理與后固定（本實驗不做此步）
1） 用10ul/ml的蛋白酶K在室溫下處理胚胎。5體節以下的胚胎不處理，5體節到24小時的胚胎處理3分鐘，24小時以上的胚胎處理5分鐘或者更長。發育時間越短的胚胎越嫩，可以不用或者少用蛋白酶處理，發育時間長的胚胎就需要用蛋白酶來疏松組織，以便于雜交。
2） 用PBST溶液輕洗，在PBST中放置5分鐘。
3） 用4％多聚甲醛的PBS溶液固定20分鐘，室溫。
4） 用PBST洗兩次，每次放置五分鐘，室溫。

2. 預雜交
1）每個管中置換成大約300ulHYB－溶液，60℃水浴5分鐘，避免振蕩。
2）用等體積的HYB＋取代HYB－。
3）60℃水浴，預雜交4小時以上。

3. 雜交
1）吸去預雜交的HYB＋，加上100ul已加入探針的HYB＋溶液（探針濃度約為1ng/ul）..
2）60℃ 溫浴過夜。
注：雜交與預雜交的溫度可以是55到60度不等，溫度越低，探針結合越好，溫度越高，背景越小。

二. 原位雜交第二天
1.
1）將探針回收，放于－20C保存(通常探針可重復使用十次左右)。
2）加入50%甲酰胺/2XSSCT溶液1毫升，60℃，放置30分鐘，重復一次。
3）置換2XSSCT1ml，60℃，放置15分鐘。
4）置換0.2XSSCT1ml，60℃，放置30分鐘，重復一次。

2.
1）用MABT洗兩次，每次五分鐘，放在搖床輕輕搖動。
2）室溫下加1ml 1：2：7溶液，時間為一小時。
3）按1：3000的比例在1：2：7溶液中加入酶連地高辛抗體，4C 冰箱過夜。

三. 原位雜交第三天
1） 用1ml含10％熱滅活血清的MABT溶液置換抗體溶液，放置搖床上25分鐘，然后用1mlMABT置換，25分鐘，再用1mlMABT溶液置換，一小時以上，最后用1mlMABT溶液置換，25分鐘。
2） 用1ml 1mM左旋米睉的Staining buffer洗三次，每次放置五分鐘。
3）將胚胎轉入十六孔板中，吸去staining buffer，加上300ul BM Purple AP Substrate(底物，用之前加5mM左旋米唑)，十六孔板外面包上錫箔紙以避光，避免搖動，室溫下顯色。
4）每隔一小時觀察胚胎是否開始顯色
5）將顯色完全的胚胎中的底物吸出，用PBST洗兩三次后加上4％多聚甲醛固定，拍照。
6）4C冰箱保存。

原位雜交中溶液的配制：
PBS:
NaCl 8g
KCl 0.2g
Na2HPO4 1.44g
KH2PO4 0.24g
DEPC H2O 1L
HCl 調PH值至7.4
抽濾，滅菌

4% 多聚甲醛：
多聚甲醛 40g
PBS 1L
加熱持續攪拌至溶液澄清。-20℃保存

PBST：
PBS溶液加上Tween-20使其終濃度為0.1%。

20XSSC:
Na3Citrate 2H2O 88.2g
NaCl 175.5g
DEPC H2O 至1L
抽濾，滅菌

SSCT：
SSC加上Tween-20使其終濃度為0.1%。

HYB-：
甲酰胺：20XSSC儲液：DEPC水=2：1：1配制
加入Tween-20使其終濃度為0.1%，-20c保存。

HYB ：
HYB- 20ml
yeast RNA 10mg
heparin 1mg。
-20℃保存。

MAB：
maleic acid 11.6g
NaCl 8.8g
用固體NaOH（約7g）調至Ph=7.5
4℃保存

MABT
MAB加上Tween-20使其終濃度為0.1%.

10% blocking reagent:
blocking reagent 8g
MAB 72ml

1：2：7溶液：
滅活羊血清：10% BM blocking reagent：MABT=1：2：7
用時現配

Staining buffer：
Tris 12.1g
pH9.5
Mgcl 6H2O 10.2g,
Nacl 5.85g
Tween-20 1ml,
用之前加1M的左旋咪唑儲液，使之終濃度為1mM