限制性內(nèi)切酶可特異地結(jié)合于一段被稱為限制酶識(shí)別序列的DNA序列位點(diǎn)上并在此切割雙鏈DNA。絕大多數(shù)限制性內(nèi)切酶識(shí)別長度為4、5或6個(gè)核苷酸且呈二重對稱的特異序列，切割位點(diǎn)相對于二重對稱軸的位置因酶而異。一些酶恰在對稱軸處同時(shí)切割DNA雙鏈而產(chǎn)生帶平端的DNA片段，另一些酶則在對稱軸兩側(cè)相對的位置上分別切斷兩條鏈，產(chǎn)生帶有單鏈突出端（即粘端）的DNA片段。1個(gè)單位限制性內(nèi)切酶是指在最適條件下，在50μl體積1小時(shí)內(nèi)完全切開1μgλ噬菌體DNA所需的酶量。不同的限制性內(nèi)切酶生產(chǎn)廠家往往推薦使用截然不同的反應(yīng)條件，甚至對同一種酶也如此。但是，幾乎所有的生產(chǎn)廠家都對其生產(chǎn)的酶制劑優(yōu)化過反應(yīng)條件，因此購買的內(nèi)切酶說明書上均有其識(shí)別序列和切割位點(diǎn)，同時(shí)提供有酶切緩沖液（buffer，10×、5×）和最適條件，使得酶切反應(yīng)變得日益簡單。
一、限制性內(nèi)切酶對DNA消化的一般方案
1.限制性內(nèi)切酶反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。
2.20μl體積反應(yīng)體系如下：
DNA 0.2-1 μg
10×酶切buffer 2.0 μl
限制性內(nèi)切酶 1-2 u（單位）
加ddH2O 至 20 μl
限制性內(nèi)切酶最后加入，輕輕混勻，稍加離心，放置于最適溫度水浴并按所需的時(shí)間溫育，一般為37℃水浴消化1hr。
3.用于回收酶切片段時(shí)，反應(yīng)總體積可達(dá)50-200μl，各反應(yīng)組分需相應(yīng)增加。
4.多種酶消化時(shí)若緩沖液條件相同，可同時(shí)加入；否則，先做低溫或低鹽的酶消化，再做高溫或高鹽的酶消化。
5.酶切結(jié)束時(shí)，加入0.5M EDTA（pH 8.0）使終濃度達(dá)10mM，以終止反應(yīng)。或?qū)⒎磻?yīng)管在65℃水浴放置10min以滅活限制性內(nèi)切酶活性。
6.如消化反應(yīng)體積過大，電泳時(shí)加樣孔盛不下，可加以濃縮：終止反應(yīng)后，加入0.6體積的5M乙酸銨（或1/10體積3M NaAc）和2倍體積無水乙醇，在冰上放置5min，然后于4℃離心12000g× 5min。傾去含大部分蛋白質(zhì)的上清液。于室溫晾干DNA沉淀后溶于適量TE中（pH 7.6）。
7.如要純化消化后的DNA，可用等體積酚/氯仿（1∶1）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。
二、電泳檢測
取質(zhì)粒酶切產(chǎn)物適量，加適當(dāng)loading buffer混勻上樣，以未經(jīng)酶切的質(zhì)粒或/和酶切的空載體（如有）作對照，采用 1-5V/cm的電壓，使DNA分子從負(fù)極向正極移動(dòng)，至合適位置取出置紫外燈下檢測，攝片。
三、注意事項(xiàng)
1. 濃縮的限制性內(nèi)切酶可在使用前以1×限制酶緩沖液稀釋，切勿用水稀釋以免酶變性。
2. 購買的限制性內(nèi)切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是穩(wěn)定的。進(jìn)行酶切消化時(shí)，將除酶以外的所有反應(yīng)成分加入后即混勻，再從-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶時(shí)都應(yīng)更換一個(gè)無菌吸頭，以免酶被污染。加酶的操作盡可能快，用完后立即將酶放回-20℃冰箱。
3.盡量減少反應(yīng)體積，但要確保酶體積不超過反應(yīng)總體積的10%，否則酶活性將受到甘油的抑制。
4.通常延長時(shí)間可使所需的酶量減少，在切割大量DNA時(shí)可用。在消化過程中可取少量反應(yīng)液進(jìn)行微量凝膠電泳以檢測消化進(jìn)程。
5.注意星號(hào)酶切活力。
一、限制性內(nèi)切酶對DNA消化的一般方案
1.限制性內(nèi)切酶反應(yīng)一般在滅菌的0.5ml離心管中進(jìn)行。
2.20μl體積反應(yīng)體系如下：
DNA 0.2-1 μg
10×酶切buffer 2.0 μl
限制性內(nèi)切酶 1-2 u（單位）
加ddH2O 至 20 μl
限制性內(nèi)切酶最后加入，輕輕混勻，稍加離心，放置于最適溫度水浴并按所需的時(shí)間溫育，一般為37℃水浴消化1hr。
3.用于回收酶切片段時(shí)，反應(yīng)總體積可達(dá)50-200μl，各反應(yīng)組分需相應(yīng)增加。
4.多種酶消化時(shí)若緩沖液條件相同，可同時(shí)加入；否則，先做低溫或低鹽的酶消化，再做高溫或高鹽的酶消化。
5.酶切結(jié)束時(shí)，加入0.5M EDTA（pH 8.0）使終濃度達(dá)10mM，以終止反應(yīng)。或?qū)⒎磻?yīng)管在65℃水浴放置10min以滅活限制性內(nèi)切酶活性。
6.如消化反應(yīng)體積過大，電泳時(shí)加樣孔盛不下，可加以濃縮：終止反應(yīng)后，加入0.6體積的5M乙酸銨（或1/10體積3M NaAc）和2倍體積無水乙醇，在冰上放置5min，然后于4℃離心12000g× 5min。傾去含大部分蛋白質(zhì)的上清液。于室溫晾干DNA沉淀后溶于適量TE中（pH 7.6）。
7.如要純化消化后的DNA，可用等體積酚/氯仿（1∶1）和氯仿各抽提一次，再用乙醇沉淀。
二、電泳檢測
取質(zhì)粒酶切產(chǎn)物適量，加適當(dāng)loading buffer混勻上樣，以未經(jīng)酶切的質(zhì)粒或/和酶切的空載體（如有）作對照，采用 1-5V/cm的電壓，使DNA分子從負(fù)極向正極移動(dòng)，至合適位置取出置紫外燈下檢測，攝片。
三、注意事項(xiàng)
1. 濃縮的限制性內(nèi)切酶可在使用前以1×限制酶緩沖液稀釋，切勿用水稀釋以免酶變性。
2. 購買的限制性內(nèi)切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是穩(wěn)定的。進(jìn)行酶切消化時(shí)，將除酶以外的所有反應(yīng)成分加入后即混勻，再從-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。每次取酶時(shí)都應(yīng)更換一個(gè)無菌吸頭，以免酶被污染。加酶的操作盡可能快，用完后立即將酶放回-20℃冰箱。
3.盡量減少反應(yīng)體積，但要確保酶體積不超過反應(yīng)總體積的10%，否則酶活性將受到甘油的抑制。
4.通常延長時(shí)間可使所需的酶量減少，在切割大量DNA時(shí)可用。在消化過程中可取少量反應(yīng)液進(jìn)行微量凝膠電泳以檢測消化進(jìn)程。
5.注意星號(hào)酶切活力。
