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蛋白質(zhì)組學(xué)入門-酶解篇

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-06-28

1. 用 Trypsin 酶解蛋白質(zhì)時(shí),碳酸氫氨的濃度應(yīng)該是多少?
酶解時(shí)碳酸氫氨的濃度一般在 10 ~ 50 mM 之間。碳酸氫氨的作用主要是提供一個(gè)堿性的水解環(huán)境,因?yàn)?Typsin 的活力在 pH8 ~ 9 之間最高。最常用的碳酸氫氨濃度有 20 mM , 40 mM 。鹽濃度過(guò)大時(shí),后續(xù)的凍干過(guò)程中會(huì)有較多的鹽析出;鹽濃度過(guò)小時(shí),則不能有效的提供堿性 pH 的水解環(huán)境(尤其是在樣品的 pH 值低,而且體積大時(shí))。為了確定酶解體系的 pH 值,可以用

2. Trypsin 儲(chǔ)存液的作用是什么?
Trypsin 在 pH8 ~ 9 活力最高,所以為了防止酶的自水解, Trypsin 母液要處于一個(gè)酸性的環(huán)境里以便長(zhǎng)期保存。 Trypsin 儲(chǔ)存液的 pH 大約是 5.3 ,是用來(lái)稀釋母液用的。如果所需的酶量較大,可以直接用碳酸氫氨溶液來(lái)稀釋母液。如果酶解的樣品少,可以用儲(chǔ)存液來(lái)稀釋,這樣剩余的酶液可以在 -800C 保存到下次使用。

3. Roche 的酶和 Promega 的酶,那個(gè)更好?
Roche 的酶有自降解,而 Promega 的酶基本上沒(méi)有自降解。由于酶的自降解峰可以用來(lái)做很好的內(nèi)標(biāo),所以一定限度的酶自降解對(duì) MALDI 數(shù)據(jù)的校準(zhǔn)很有幫助。

4. 什么情況下需要用 Ziptip 來(lái)處理樣品?
當(dāng)樣品含有大量的鹽時(shí),需要用 Ziptip 來(lái)除鹽;當(dāng)樣品量很少,但體積比較大時(shí)( 20 微升以上)時(shí),需要用 Ziptip 來(lái)濃縮。如果樣品中有甘油, SDS ,或其他雜質(zhì)時(shí), Ziptip 的使用要格外當(dāng)心,在這種情況下, Ziptip 的填料容易被雜質(zhì)堵塞;另外 Ziptip 使用不當(dāng)時(shí),樣品會(huì)有損失。所以當(dāng)樣品比較珍貴(的來(lái)不易)時(shí),最好先用其他樣品做預(yù)實(shí)驗(yàn),摸順條件后,再作真正的樣品。

 
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