1)離心沉淀cDNA第一鏈，并重懸在50μl水中，加50μl 2×第二鏈緩沖液(0.2mol／L Hepes，pH6.9，20m mol／L MgCl2，5 m mol／L DTT，0.14 mol／L KCl，1 m mol／L 4種Dntp)，混合均勻。
2)每微克底物加大腸桿菌DNA聚合酶K1enow片段20～50單位，15℃反應20小時，此酶能識別cDNA 3’末端發卡環，并以其為引物，cDNA第一鏈為模板，開始第二鏈的合成。
3)加0.5 mol／L EDTA 2μl終止反應。取樣電泳，以提取第一鏈同樣的方法分離沉淀dsDNA。
對于這樣合成的dsDNA不是全長的DNA分子，所以，需要進一步用逆轉錄酶合成。
4)溶解上述dsDNA在20μl水中，再加入：1mol／L Tris.HCl pH8.3)5μl，1 mol／L KCl 7μl,250m mol／L MgCl2 2μl，20m mol／L 4種‘dNTP各2.5μl,700m mol／L β-MCE 2μl，加重煎水到48μl，加逆轉錄酶2μl (40單位)、42℃保溫反應1小時。
5)加0.5 mol／L EDTA 2μl終止反應，取樣電泳，以同樣方法抽提，分離沉淀dsDNA。
6)用兩次合成的雙鏈cDNA和單鏈cDNA在1.4％堿性瓊脂糖凝膠上電泳，放射自顯影后觀察，如果dsDNA片段的長度是第一鏈cDNA的兩倍，那么，合成便是成功的。
7)用核酸酶S1消化dsDNA，除去連接兩條鏈的發卡環。