等電聚焦（isoelectric focusing，IEF）是60年代中期問世的一種利用有pH梯度的介質分離等電點不同的蛋白質的電泳技術。由于其分辨率可達0.01pH單位，因此特別適合于分離分子量相近而等電點不同的蛋白質組分。

　　⒈IEF的基本原理 在IEF的電泳中，具有pH梯度的介質其分布是從陽極到陰極，pH值逐漸增大。如前所述，蛋白質分子具有兩性解離及等電點的特征，這樣在堿性區域蛋白質分子帶負電荷向陽極移動，直至某一pH位點時失去電荷而停止移動，此處介質的pH恰好等于聚焦蛋白質分子的等電點（pl）。同理，位于酸性區域的蛋白質分子帶正電荷向陰極移動，直到它們的等電點上聚焦為止。可見在該方法中，等電點是蛋白質組分的特性量度，將等電點不同的蛋白質混合物加入有pH梯度的凝膠介質中，在電場內經過一定時間后，各組分將分別聚焦在各自等電點相應的pH位置上，形成分離的蛋白質區帶。

　　⒉pH梯度的組成 pH梯度的組成方式有二種，一種是人工pH梯度，由于其不穩定，重復性差，現已不再使用。另一種是天然pH梯度。天然pH梯度的建立是在水平板或電泳管正負極間引入等電點彼此接近的一系列兩性電解質的混合物，在正極端吸入酸液，如硫酸、磷酸或醋酸等，在負極端引入堿液，如氫氧化鈉、氨水等。電泳開始前兩性電解質的混合物pH為一均值，即各段介質中的pH相等，用pH0表示。電泳開始后，混合物中pH最低的分子，帶負電荷最多，pI1為其等電點，向正極移動速度最快，當移動到正極附近的酸液界面時，pH突然下降，甚至接近或稍低于PI1，這一分子不再向前移動而停留在此區域內。由于兩性電解質具有一定的緩沖能力，使其周圍一定的區域內介質的pH保持在它的等電點范圍。pH稍高的第二種兩性電解質，其等電點為pI2，也移向正極，由于pI2＞pI1，因此定位于第一種兩性電解質之后，這樣，經過一定時間后，具有不同等電點的兩性電解質按各自的等電點依次排列，形成了從正極到負極等電點遞增，由低到高的線性pH梯度。

　　⒊兩性電解質載體與支持介質 理想的兩性電解質載體應在pI處有足夠的緩沖能力及電導，前者保證pH梯度的穩定，后者允許一定的電流通過。不同pI的兩性電解質應有相似的電導系數從而使整個體系的電導均勻。兩性電解質的分子量要小，易于應用分子篩或透析方法將其與被分離的高分子物質分開，而且不應與被分離物質發生反應或使之變性。

　　常用的pH梯度支持介質有聚丙烯酰胺凝膠、瓊脂糖凝膠、葡聚糖凝膠等，其中聚丙烯酰胺凝膠為最常應用。

　　電泳后，不可用染色劑直接染色，因為常用的蛋白質染色劑也能和兩性電解質結合，因此應先將凝膠浸泡在5％的三氯醋酸中去除兩性電解質，然后再以適當的方法染色。