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凝膠層析法

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-06

1.凝膠的選擇 根據(jù)層析物質(zhì)分子量的大小選擇不同型號(hào)的凝膠,如除鹽和除游離的熒光素,則可選用粗、中粒度的G28或G500,G250多用于分離蛋白質(zhì)單體,G200多用于分離蛋白質(zhì)凝膠聚合體等。

2.凝膠的預(yù)處理 稱取適量的凝膠加入過量的緩沖液在冰箱(或室溫)中充分膨脹,或在沸水中煮,膨脹時(shí)間應(yīng)根據(jù)不同型號(hào)的凝膠而定。為使粒子均勻一致需進(jìn)行浮選,即加入凝膠粒子后,輕輕攪拌,靜置20min,傾去沉淀的粒子,如此反復(fù)數(shù)次即可。

3.裝柱 層析柱的選擇一般根據(jù)分離樣品的種類和樣品的數(shù)量而定。純化蛋白質(zhì)時(shí),柱床體積應(yīng)為樣品體積的25~100倍。去鹽、游離熒光素約為樣品體積的4~10倍。柱太短,影響分離效果。柱長(zhǎng)一些,分離效果好,但柱太長(zhǎng),則延長(zhǎng)分離時(shí)間,樣品也稀釋過度。層析柱的內(nèi)徑也要選擇適當(dāng)。內(nèi)徑過細(xì),會(huì)發(fā)生“器壁效應(yīng)”,即靠近管壁的流速要大于中心的流速影響分離效果。所以層析柱的內(nèi)徑和高度應(yīng)有一定的比例。對(duì)于除鹽來說應(yīng)為1︰5~1︰25;對(duì)于純化蛋白質(zhì)來說應(yīng)為1︰20~1︰100。

裝柱過程基本同離子交換層析柱。

4.加樣與洗脫 樣品體積不宜過多,最好為床體積的1%~5%,最多不要超過10%。樣品濃度也不宜過大,濃度過大粘度大,分離效果差,一般不超過4%。

洗脫液應(yīng)與膨脹一致,否則更換溶劑,凝膠體積會(huì)發(fā)生變化,影響分離效果。洗脫液要有一定的離子強(qiáng)度和pH值。分離血清蛋白常用0.02~0.1Mol/L pH 6.9~8.0的PBS液(0.14Mol/L NaCl)和0.1Mol/L pH8.0Tris-HCl緩沖鹽溶液(0.14Mol/L NaCl)。

5.洗脫液收集 同離子交換層析。

6.凝膠柱的重復(fù)使用與保存 當(dāng)樣品的各組分全部洗脫下來之后,即可加入新的樣品,繼續(xù)使用。保存方法有三種:

⑴ 在液相中保存最方便,即于凝膠懸液中加入防腐劑(一般為0.02%N2N3或0.002%洗必泰)或高壓滅菌后4℃保存。此法至少可以保存半年以上。

⑵ 用完后,以水沖洗,然后用60%~70%酒精液沖洗,凝膠體積縮小,即在半收縮狀態(tài)下保存。

⑶ 長(zhǎng)期不用者,最好以干燥狀態(tài)保存,即水洗凈后,用含乙醇的水洗,逐漸加大乙醇用量,最后用95%的乙醇洗,可全部去水,再用乙烯去除乙醇,抽濾干,于60℃~80℃干燥后保存。

 
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