雜交反應的條件類似于傳統的Southern或Northern雜交。具體的選擇視研究目的而定，例如，進行多態性分析或雜交測序時，要求能夠區分單個堿基的變異，所以需要較高的雜交嚴謹性；而用于表達譜檢測的芯片為了提高檢測的特異性、保證較高的靈敏度，需要較長的雜交時間，高的嚴謹性、高的樣品濃度、較低的雜交溫度等。同時，雜交反應還必需考慮反應液中的鹽濃度、探針序列的G C含量、探針所帶電荷情況、探針與芯片片基間連接臂的長度及種類，靶序列二級結構等因素。固定于芯片表面的探針或蛋白、多肽分子與位于液相的靶分子進行生化反應（作用）的過程不完全與液相中生化反應相同。其原因在于，生物大分子與固相支持物的結合導致了溶液中的靶分子與其不能迅速地發生作用，延長了反應時間，必要時還必需提高靶分子的濃度以加快反應。而且，固相化的大分子，特別是空間體積較小的分子，很容易受到支持物對生化反應的空間阻礙作用。如何解決以上問題是生物芯片技術應用中的關鍵之一。 有研究表明，在探針分子與片基間加入適當長度的連接臂可使雜交效率提高上百倍。連接臂將固相化的探針分子與支持物隔開一定的距離，減少空間阻礙作用。另外，不帶電荷的肽核酸(PNA)也可與DNA形成PNA-DNA雜交體，且比DNA-DNA或DNA-RNA雜交體更為穩定的，防止核酸二級結構對雜交反應的影響，所以適合進行單個堿基錯配的分析。PNA還能夠抵御蛋白酶與核酸酶的降解，具有很高的穩定性[4]。目前由于PNA合成難度較大、成本高尚未得到大量的應用。為加快雜交反應速度，美國Nanogen公司研制的電子芯片通過在雜交位點引如電場而使雜交和沖洗過程速度大大增加。它在1mm2的位點上制作有微電極陣列，其上覆以鏈親和素標記的瓊脂糖[5,6]。生物素標記的探針分子可快速地結合到位于電極上方的瓊脂糖上，從而提高了雜交速度。其原理為:當位于待檢位點鏈親和素標記的瓊脂糖凝膠下方的微電極引入直流正電壓后，溶液中的生物素標記化的探針就可在電場的作用下快速泳動并濃縮結合于該處。同樣的道理，可以使待檢的DNA分子快速濃縮于此，從而有力地雜交反應迅速進行。雜交完成后，改變電場方向、可將未雜交的樣品DNA從檢測位點“洗”去，選擇適當的電場強度就可以使非特異雜交的DNA與未雜交的探針選擇性地從特定位點分開除去，而保留完全雜交的DNA分子。由于電場的這種濃縮和選擇特性，使得該方法有很高的靈敏度和特異性，最重要的是它使原來數小時的雜交反應縮短到二三十秒鐘。Gene Logic公司研制的生物芯片將探針分子固定與微通道內，標記后的核酸樣品流過時便會濃縮富集于通道內，同樣也可縮短雜交過程，提高檢測的靈敏度，降低試劑消耗。