用DNA重組技術將某種生物的總DNA用特定的限制性內切酶切割成一個個片段，然后將這些片段隨機地連接在某些質粒或其他載體上，再將它們轉移到適當的宿主細胞中，通過細胞的增殖而構成各個片段的無性繁殖系（克隆），當這些克隆多到可以包括某種生物的全部基因時，這一批克隆的總體就稱為該種生物的基因文庫。這一定義也適用于線粒體DNA和葉綠體DNA，分別稱為某種生物的線粒體基因文庫或葉綠體基因文庫。為了有效地保存基因文庫，可通過細菌在固體培養基上繁殖而使包含各個特定DNA片段的細菌增多。通過分子雜交的方法，可以篩選出包含有所需基因的DNA片段的細菌（或噬菌體）。經過擴增得到大量這樣的細菌（或噬菌體），從中便可分離出所需基因的DNA片段。建立和使用基因文庫是分離高等真核生物基因的有效手段，對于基因定位和基因工程的研究都很有用。