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基因轉(zhuǎn)染技術

放大字體  縮小字體 發(fā)布日期:2006-07-01
常用的基因轉(zhuǎn)染技術是將外源基因?qū)氚屑毎枰欢ǖ妮d體和導入方法,基因轉(zhuǎn)技術則是將純化的含有靶基因的質(zhì)粒DNA送入細胞內(nèi),并在細胞內(nèi)表達。轉(zhuǎn)染方法有多種,根據(jù)不同的細胞,貼壁或懸浮細所可選用不同的方法,其目的是要達到設置轉(zhuǎn)染效率,影響轉(zhuǎn)染產(chǎn)率的因素有多種,包括轉(zhuǎn)染方法、操作技術、質(zhì)粒DNA的純度、靶細胞的生長狀態(tài)等,下面重點介紹向幾種常用的轉(zhuǎn)染技術:
被用于作靶基因轉(zhuǎn)染的細胞,其生長狀態(tài)如何,將直接決定了基因轉(zhuǎn)染效率。如為貼壁生長的細胞,一般要求在轉(zhuǎn)染前一日,必需應用胰酶處理成單細胞懸液,重新接種于培養(yǎng)皿或瓶,細胞密度以鋪滿培養(yǎng)器皿的60%為宜,轉(zhuǎn)染當日,在轉(zhuǎn)染前4小時換一將近新鮮培養(yǎng)液。對于懸浮細胞,也需在轉(zhuǎn)染前4小時換一次新鮮培養(yǎng)液。
用于轉(zhuǎn)染的質(zhì)粒DNA必須無蛋白質(zhì),無RNA和其了化學物質(zhì)的污染,OD260/280比值應在1.8以上。應用酚-氯仿抽提法制備的質(zhì)粒DNA一般難以達到此標準,目前大多采用進口的術提取純化試劑盒。
具體的基因轉(zhuǎn)染技術有鱗酸鈣介導的轉(zhuǎn)染法、DEAE葡聚糖介導轉(zhuǎn)染法、脂質(zhì)體介導轉(zhuǎn)染法及電擊基因轉(zhuǎn)導塵等。靶基因被導入細胞后,一般在轉(zhuǎn)染后48小時,靶基因即在細胞內(nèi)表達。根據(jù)不同的實驗目的,48小時后即可進行靶基因表達的檢測等實驗。如若建立穩(wěn)定的細胞系,則可對靶細胞進行篩選,根據(jù)不同基因載體中所含有的抗性標志選用相應的藥物,最常用的直核表達基因載體的標志物有潮霉素(hygromycin)和新霉素(neomycin)。
 
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