指高能化合物的放能水解作用或與基團轉移相偶聯的ATP合成作用。不包括光合磷酸化或呼吸鏈中氧化磷酸化的ATP生成過程。例如：糖酵解途徑中產生的高能磷酸化合物甘油酸-1，3-二磷酸和烯醇式磷酸丙酮酸在酶的作用下，高能磷酸基團轉移到ADP分子上生成ATP。又如三羧酸循環中產生的高能硫酯化合物琥珀酰輔酶A在酶的作用下水解成琥珀酸，同時使GDP磷酸化為GTP，GTP再與ADP作用生成ATP。這些都是底物水平磷酸化的實例。底物水平磷酸化沒有共同的作用機制。
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